干细胞培养上清液及外泌体

干细胞培养上清液是培养干细胞时干细胞分泌的生理活性物质的集合，但不含干细胞。其含有丰富的细胞外囊泡（EVs、外泌体等）、细胞因子（生长因子等）。近年来，外泌体受到关注，并开始应用于医疗，其中大部分是来源于间叶系干细胞培养上清液，或者从培养上清液分离的外泌体。

本院使用的干细胞培养上清液是从乳牙髓、脐带、脂肪和骨髓这4种间叶系干细胞中分别导入不死化基因形成的克隆化细胞中制备，从而保证制剂的安全性、同质性和稳定供应。尽管有人指出导入不死化基因可能带来“癌化”的风险，但动物实验、RNA分析的结果恰恰相反，导入不死化基因有抑制“癌化”的作用。所以所谓的“癌化”的风险没有科学依据。最重要的是，我们已经有了8年的临床实绩，这些临床数据证实了干细胞培养上清液应用的安全性。

再生医疗的研究以细胞移植为中心的研究发展而来。最初确立的再生医疗技术是皮肤的移植。这项技术在 20 世纪 70 年代被确立，此后，世界各地都在开展培养皮肤移植，在日本也被批准为再生医疗产品。移植体外培养制备的皮肤可以导致皮肤的再生。令人惊讶的是，移植的皮肤并不会存活固定下来，2周左右就会消失，但是皮肤还是会再生。

名古屋大学上田实名誉教授在经历过多次移植培养皮肤后出现的这个现象后，产生了“再生医疗需要细胞移植吗？”这样的疑问，并在名古屋大学进行了研究。结果得出了“再生医疗中细胞移植并不一定是必要的，通过细胞分泌的生理活性物质也可能实现再生医疗”的结论。这些研究是使用干细胞培养上清液的临床应用为基础。

以下关于疾病的研究论文刊登在医学杂志上。

本院除了这些基础研究数据外，还参考了制剂制造委托公司进行的动物实验的安全性检查、人体安全性及有效性为目的的临床研究，以及全世界发表的论文和临床实绩，从而提出具有科学有效性的治疗方案。

从2000年代后半期开始，再生医疗作为下一代医疗开始受到关注，日本的山中伸弥因为iPS细胞获得了2012年诺贝尔生理学、医学奖，更加引起了人们的关注。日本的再生医疗的研究很盛行，率先出台了一系列相关法律，2014年实施了“关于确保再生医疗等安全性的法律”。此时，由于干细胞培养上清液没有含有细胞，因此不在新法对象之列。因此，使用干细胞培养上清液的临床应用，在医生法下可以作为自由诊疗实施。

从2015年左右开始，随着技术的进步，微小物质的分析成为可能，50~150纳米（nm，10的-9次方）的外泌体作为促进再生的物质开始受到关注。现在，外泌体被称为细胞外囊泡（EVs）（外泌体是EVs之一），有可能成为再生医疗的主角。

细胞外囊泡是细胞分泌的泡状小囊，内含DNA、mRNA（信使RNA）、miRNA（微小RNA）、蛋白质等，作为细胞间的信息传递物质参与体内的所有反应。这些反应有可以治愈疾病，也有可以使疾病发病或恶化的反应。与这些反应密切相关的是miRNA。

2020年以后，外泌体应用成为热潮，干细胞培养上清液、外泌体点滴在自由诊疗中的应用进一步扩大，但缺乏安全性和质量确认的制剂很多，让人担心医疗事故的发生。质量差的制剂会增加疾病发病和恶化的风险。

2024年7月，厚生劳动省医政局研究开发政策课发布了“关于使用干细胞培养上清液及外泌体等用于医疗（通知）”，以确保医疗安全的行政通知。

本院在充分理解细胞外囊泡的品质及风险概况的基础上，努力确保使用细胞外囊泡应用的科学合理性和确保患者的安全性。

细胞外囊泡的品质中重要的是在高维度上保持其匀质性。为此，只使用从克隆（不死化）细胞中制备的培养上清液应用于临床。另外，由于细胞的种类不同，miRNA的表达也不同，所以根据疾病分别使用4种不同间叶系干细胞（乳牙髓、脐带、脂肪、骨髓）来源的培养上清液进行治疗。

本院使用的干细胞培养上清液（乳牙髓）平均含有400亿pixel/ml的外泌体。但是，即使是现在的技术也很难准确测量外泌体的数量，据说外泌体的回收率为10-50%。回收率有这么大的幅度，因此除了比较检查以外，用数量比较外泌体是没有意义的。可以通过增加细胞培养时的数量或浓缩培养液来提高外泌体的数量，而癌细胞和老化细胞产生更多的外泌体。

因此，制剂的好坏不应根据外泌体的数量来判断，重要的是通过miRNA是否平衡地表达等来进行综合判断。

培养上清液中含有的生长因子的种类和数量，对于确认制剂是否保持均匀质可能有效，但对治疗效果似乎没有意义。

通过培养上清液的给药，体内和细胞内根据需要合成的蛋白质可以发挥治疗效果。因此，miRNA平衡地表达显的非常重要。